相关介绍： 

　　螯合金属离子亲和层析（IMAC）琼脂糖凝胶FF具有螯合金属离子的能力，如螯合Cu2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Fe3+等，螯合金属离子后可用于富含组氨酸、色氨酸、半胱氨酸的蛋白质纯化，其中最常见的是用于融合了6-8个组氨酸标签的蛋白质纯化。与IDA琼脂糖凝胶FF相比，IMAC琼脂糖凝胶FF一般可以更牢固的结合金属离子，在纯化标签蛋白方面，有可能获得更高纯度的样品。

技术指标：

使用方法：

1、色谱柱装填

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的蒸馏水。

（3）将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降，建议柱床高度不超过20cm。

（4）柱压不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则正常使用流速填装。

（5）填装好的IMAC琼脂糖凝胶FF柱用5个柱体积蒸馏水清洗，使用的流速建议为100cm/h。

2 螯合金属离子

（1）根据需要选择金属盐，一般配置0.1-0.2M金属盐溶液，常见的有CuSO4、ZnSO4、NiSO4、CoCl2等。注意金属盐溶液的pH以偏酸性为宜（如pH4-6，Fe3+一般需要pH3），防止在螯合时pH上升产生沉淀。

（2）蒸馏水清洗后的IMAC琼脂糖凝胶FF用1-3个柱体积金属盐溶液过柱螯合金属离子，然后用5个柱体积以上的蒸馏水清洗层析柱，去除游离的金属盐溶液。

（3）用5个柱体积以上的乙酸缓冲液（20mM 乙酸-乙酸钠，1M 氯化钠，pH4.0）清洗，去除结合不牢固的金属离子，减少在使用过程的脱落。

（4）处理完后可用结合缓冲液平衡层析柱，用于目标蛋白的纯化。

3、纯化目标蛋白

（1）选择缓冲液：一般选用pH6-8的结合缓冲液，常用缓冲液有10-00mM 磷酸钠缓冲液、20-200mM Tris-HCl缓冲液等。在缓冲液中一般要加入0.15-0.5M的NaCl，以消除离子交换作用。在初次使用IMAC琼脂糖凝胶FF，推荐使用50mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作为结合缓冲液。

（2）样品处理：样品的缓冲液应与所选结合缓冲液一致。为保证缓冲液一致，可以在结合缓冲液中破碎细菌、或调解pH与结合缓冲液一致、或交换至结合缓冲液（常用方法有透析、超滤、脱盐柱换液等）、或用结合缓冲液稀释2-10倍等。样品上柱前应0.45μm过滤。

（3）平衡上样：螯合金属离子的IMAC琼脂糖凝胶FF用结合缓冲液平衡5个柱体积，然后将样品上柱，上完样后，用结合缓冲液平衡。

（4）洗脱优化：螯合金属离子的IMAC琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱。初次实验不知道洗脱的咪唑浓度，可尝试不同的浓度洗脱，建议在结合缓冲液中分别加入5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑（咪唑为碱性物质，加入咪唑后需重新调节pH），浓度从低到高，先后分别洗脱和收集，通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱组份。

4、再生清洗

（1）多次使用后或需要更换螯合的金属离子，必须将凝胶脱去金属离子再生。脱金属离子方法：用5-10个柱体积蒸馏水淋洗柱子，再用10个以上柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子，再用3-5个柱体积的0.5M NaCl洗掉残留的EDTA。

（2）多次使用的柱子脱镍后一般需要清洗。清洗方法：用0.1-1.0M NaOH反向清洗柱子，流速50cm/h，保持1-2h，能去除结合强的杂质，同时也能去除热源。NaOH清洗后应立即用5个柱体积以上的蒸馏水清洗至中性，清洗后可按照螯合金属离子的方法重新螯合金属离子。

5、保存

IMAC琼脂糖凝胶FF和螯合金属离子后的IMAC琼脂糖凝胶FF都可以用20%乙醇保存，一般蒸馏水清洗后，用3个柱体积20%乙醇清洗。20%乙醇清洗后的层析柱和凝胶可放置在2-25℃条件下保存。